Cloning, sequence analysis,
expression of Cyathus bulleri laccase in Pichia pastoris and characterization
of recombinant laccase
autores: Neha Garg, Nora Bieler, Tenzin
Kenzom, Meenu Chhabra, Marion Ansorge-Schumacher and Saroj Mishra
BMC
Biotechnology 2012, 12:75 doi:10.1186/1472-6750-12-75
Fondo
Las lacasas
son azules de cobre multi-oxidasas y catalizar la oxidación de compuestos
fenólicos y no-fenólicos. Existe un considerable interés en el uso de estas
enzimas para la degradación de colorante, así como para la síntesis de
compuestos aromáticos. Las lacasas son producidas a niveles relativamente bajos
y, a veces, como isoenzimas en los hongos nativos. La investigación de las
propiedades de las enzimas individuales por lo tanto se hace difícil. El
objetivo de este estudio fue producir en exceso una lacasa se informó
anteriormente de Cyathus bulleri utilizando el sistema de expresión bien establecida
de Pichia pastoris y examinar y comparar las propiedades de la enzima
recombinante con el de la lacasa nativa.
Resultados
En este
estudio, lacasa completa ADNc que codifica (Lac) de podredumbre blanca hongo
Cyathus bulleri se amplificó por RACE-PCR, clonado y expresado en el
sobrenadante de cultivo de Pichia pastoris bajo el control de la alcohol
oxidasa (AOX) 1 promotor. La región de codificación consistía en 1.542 pb y
codifica una proteína de 513 aminoácidos con un péptido señal de 16
aminoácidos. La secuencia de aminoácidos deducida de la proteína madura muestra
una alta homología con las lacasas de Trametes versicolor y Coprinus cinereus.
El análisis de la secuencia indicó la presencia de Glu 460 y Ser 113 y
tripéptido LEL en la posición sabe que influyen en el potencial redox de las
lacasas la puesta de esta enzima como una enzima redox alta. La adición de
sulfato de cobre al medio de producción mejorado el nivel de lacasa con
aproximadamente 12-veces a una actividad final de 7200 U L-1. La lacasa recombinante
(RLAC) se purificó por ~ 4-veces a una actividad específica de ~ 85 U mg
proteína-1. Un estudio detallado de la termoestabilidad, cloruro y la
tolerancia de disolvente de la RLAC indicaron mejora en las dos primeras
propiedades en comparación con la lacasa nativa (NLAC). Patrón de glicosilación
alterado, identificado por impresión péptido dedo masa, fue propuesta para
contribuir a las propiedades alteradas de la RLAC.
Conclusión
Lacasa de C.
bulleri fue producido con éxito extracelularmente a un alto nivel de 7200 U L-1
en P. pastoris bajo el control del promotor de AOX1 y se purificó mediante un
simple procedimiento de tres pasos a homogeneidad. Los parámetros cinéticos
contra ABTS, guayacol y pirogalol fueron similares con la NLAC y la RLAC. Tríptico
análisis de huellas dactilares de la NLAC RLAC y la alteración de los patrones
de glicosilación indicado. Aumento de la tolerancia termo-estabilidad y la sal
de la RLAC se atribuyó a este patrón cambió de glicosilación.
ver mas en:
http://www.biomedcentral.com/1472-6750/12/75/abstract
tomado de envío de BCM
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